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詳解細(xì)胞因子試劑盒的五種檢測方法
2019-07-18 瀏覽次數(shù)：2691
細(xì)胞因子試劑盒主要用于科研方面，不用于臨床診斷，可以用于檢測各種指標(biāo)。做快速檢測時(shí)，待檢測的樣品數(shù)越多，出現(xiàn)加錯(cuò)的概率也就越大，特別容易出錯(cuò)的是在酶聯(lián)偶合物（conjugate）與樣品液或標(biāo)液混合的階段，因?yàn)檫@時(shí)使用的是單道槍。其實(shí)解決的方法比較簡單，我們只要把操作上的順序加以調(diào)換，即先把待測液或標(biāo)液加入稀釋孔中，再加入酶聯(lián)偶合物就不會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤了。而且這兩個(gè)順序交還對結(jié)果也沒有影響，因?yàn)檫@一步的主要目的是讓兩種液體充分混合。
接下來就來介紹下細(xì)胞因子試劑盒的五個(gè)檢測方法：
一、間接法：使用了二抗增加信號(hào)強(qiáng)度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。間接法只能用于測定抗體，主要用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)是只需要改變包被抗原，酶標(biāo)抗體是通用的。
二、捕獲法：全稱捕獲包被法也稱為反向間接法，主要用于測定血清中某類抗體亞型如IgM。為排除血清中IgG的干擾，用抗IgM抗體包被后用于捕捉樣本中的IgM，然后加入特異性結(jié)合抗原進(jìn)行后續(xù)檢測。捕獲包被法常用于對病毒性感染的早期診斷。在測定IgM的實(shí)驗(yàn)中常受到類風(fēng)濕因子（RF，一種能結(jié)合多種動(dòng)物IgG Fc的自身IgM抗體）的干擾，導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。采用F(ab')或Fab片段制備酶標(biāo)抗體可以消除RF的干擾，這一方法在雙抗體夾心法中也具有同樣的效用。
三、競爭法：是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競爭性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體（或抗原）濃度越高，則能與固定抗原（或抗體）結(jié)合的酶標(biāo)抗體（或抗原）就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對照相比，顯色越淺，表示檢測樣本中抗體（或抗原）含量越高。該法特別適合小分子物質(zhì)的檢測也可用于檢測比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測的靈敏度和專一性較差。競爭法測抗原常用于檢測小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個(gè)以上的識(shí)別位點(diǎn)，不適用于雙抗夾心法進(jìn)行測定。該方法在商業(yè)化ELISA試劑盒中被廣泛運(yùn)用。競爭法測抗體常常用于檢測某些干擾物質(zhì)不易去除的樣本及難以純化得到抗原等情況。下圖以固相酶標(biāo)抗原為例，固相酶標(biāo)抗體類似。其實(shí)競爭法在實(shí)際運(yùn)用中有很多的花樣和變種，以后我們再一一細(xì)說。
四、直接法：僅需要抗原和酶標(biāo)一抗，操作簡便，可避免交叉反應(yīng)，然而該方法要求酶標(biāo)一抗有較高的特異性要求，同時(shí)也并非所有的一抗適合標(biāo)記處理。直接法在實(shí)際運(yùn)用中并不多見，它并不能對樣本中抗體進(jìn)行定量分析，因?yàn)闃颖局锌贵w是非酶標(biāo)抗體，無法進(jìn)行后續(xù)顯色，但是該法經(jīng)過改進(jìn)就是競爭法。
五、夾心法：分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法，雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢，但該法只適用于有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗原檢測，主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關(guān)的，以及在科研中檢測細(xì)胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測過程中有時(shí)會(huì)將樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，稱為雙抗體夾心一步法，因?yàn)椴僮鲿r(shí)間短，在商業(yè)化生產(chǎn)中有很大優(yōu)勢。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應(yīng)（hook ffect），因?yàn)榇藭r(shí)如果樣本中抗原含量過高會(huì)導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而無法形成“夾心復(fù)合物”，此時(shí)測出的結(jié)果將低于實(shí)際含量甚至是陰性結(jié)果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測定樣本中抗原含量時(shí)要注意測量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。雙抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測樣本中的抗體結(jié)合于抗原后，使用酶標(biāo)的抗原進(jìn)行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng)，可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上測定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測時(shí)被測樣本不需要稀釋即可直接進(jìn)行測定，故此靈敏度相對而言高于我們隨后要說的間接法。
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